模基生物結直腸癌類器官培養基套裝

產品描述

模基生物結直腸癌類器官培養基套裝是一種化學定義的細胞培養基，用于建立和維護人結直腸癌類器官。患者來源的癌癥類器官概括了原始腫瘤的基因組和病理特征，因此在醫學研究和精準醫學方面具有巨大的前景。

產品信息

其他自備材料和試劑

MG&ABW基質膠

腫瘤組織消化液

紅細胞裂解液

類器官消化液

類器官冷凍保存培養基(無血清)  

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂  

FBS（胎牛血清）

EDTA

結直腸癌類器官完全培養基的制備

使用無菌操作技術配制結直腸癌類器官完全培養基。以下是準備 10mL 完全培養基的示例，如所需量不同，可相應調整用量。

1. 冰上解凍結直腸癌類器官培養因子B (50x)和結直腸癌類器官培養因子C(250x)。

注意： 解凍后，建議將結直腸癌類器官培養因子B (50x)和結直腸癌類器官培養因子C(250x)分別分裝后保存取用，避免反復凍融。

2. 將 200uL結直腸癌類器官培養因子B (50x)，40uL 結直腸癌類器官培養因子C(250x) 加至9.76mL結直腸癌類器官培養基礎培養基中，充分混合，配制成 10mL結直腸癌類器官完全培養基。

注意：配制后的結直腸癌類器官完全培養基可在 2-8°C 儲存，建議在兩周內使用。結直腸癌類器官培養因子B(50x)內含有細菌及真菌抗生素(50x)。

患者來源的結直腸癌類器官的原代培養

注意：涉及主要人體組織材料的研究必須遵循所有相關的機構和政府法規。在收集主要人體組織材料之前，必須獲得所有受試者的知情同意。

從初級組織中建立類器官

1.用離心管將原發性人結直腸癌組織碎片收集在冰冷的原發組織儲存溶液中。將組織樣品保持在4°C，直到分離開始。

2.評估獲得的組織碎片是否完全由上皮組成。 如果存在脂肪或肌肉組織，請在解剖顯微鏡下使用手術剪刀或手術刀和鑷子盡可能多地去除這些非上皮成分。如果沒有脂肪或肌肉組織，請立即繼續下一步。

3.用結直腸癌類器官基礎培養基或DPBS沖洗組織兩次。

4.使用手術剪刀或手術刀將組織切碎成1-3mm3的小碎片，置于細胞培養皿中。

5.在37°C下用10mL腫瘤組織消化溶液在15mL離心管中消化組織片段，消化時間可變，從30分鐘到1.5小時不等。仔細監測消化過程，可適當吹打取上清觀察消化程度。當大多數組織片段能夠通過1mL移液器吸頭時，消化過程即完成。

6.將FBS加入組織消化混合物中，最終濃度為2%，并使用100μm細胞過濾器過濾。

7.收集并在4°C下以250g離心過濾的細胞3分鐘。  在可見的紅色沉淀的情況下，吸入上清液，并使用2mL紅細胞裂解液重懸沉淀，在室溫下裂解紅細胞1分鐘，并在4°C下以250g離心3分鐘。

8.吸出上清液并將沉淀重懸于基礎培養基中，在4°C下以250g離心3分鐘，再次重復此步驟。

9.吸出上清液并將沉淀重懸于基質膠中。基質膠應保存在冰上以防止其凝固。盡快進行該過程。使用的基質膠的量取決于顆粒的大小。大約10，000個細胞應接種在25 μ L基質膠中。

10.關鍵：不要過度稀釋基質膠（基質膠應>70%（基質膠體積/總體積）），因為這可能會抑制固體液滴的正確形成。

將含有類器官的基質膠鋪在24孔細胞培養板的底部，每個液滴圍繞孔中心約30 μ L。

關鍵：一旦類器官重懸于基質膠中，盡快進行種板，因為基質膠可能會在試管或移液器吸頭中凝固。不要讓基質顆粒接觸管壁。

11.將培養板放入37°C和5%CO ₂的培養箱中15-25分鐘，讓基質凝膠固化。

12.準備所需量的結直腸癌類器官完全培養基。

13.一旦基質膠滴凝固（15-25分鐘），打開板并小心地向每個孔中加入500 μ L結直腸癌類器官完全培養基。

關鍵：不要將培養基直接添加到基質膠液滴的頂部，因為這可能會破壞已凝固結構。

14.將培養板置于37°C和5%CO ₂的恒溫培養箱中。

15.每隔3-4天更換一次培養基，小心地從孔中吸出培養基，并用新鮮的預熱的類器官完全培養基代替它。

16.密切監測類器官生長狀態，理想情況下，結直腸癌類器官應在 7 至 10 天內建成。

結直腸癌類器官的傳代培養

1、以下操作吹打細胞的吸頭均需用潤洗液潤洗后使用：

類器官收集：待結直腸癌類器官培養到直徑為200~500μm大小時（或變黑不再增大時），即可進行結直腸癌類器官的傳代（每代約5天左右）。吸棄舊培養基，加入等體積基礎培養基，用細胞刮刀或者移液管吸頭尖端輕輕刮下（或吹打）細胞外基質和結直腸癌類器官混合物，轉移至1.5ml或15ml離心管中，吹打5~10次，使結直腸癌類器官和細胞外基質分離，300g離心3分鐘。

2、類器官消化及清洗：棄上清，加入1mL基礎培養基吹打類器官5~10次，取少量懸液鏡檢觀察類器官狀態：

若類器官已分散成碎片則可選擇機械吹打分散類器官后直接300g離心3分鐘，離心后用PBS或基礎培養基清洗2次。

若類器官比較完整可300g離心3分鐘，棄上清，加入5倍于細胞外基質和結直腸癌類器官混合物體積的類器官消化液，吹打混勻后置于37℃培養箱中消化2分鐘。加入5倍于消化液體積的基礎培養基終止消化。離心后用PBS或基礎培養基清洗2次。

3、基質膠3D包裹：清洗完成后將離心沉淀中的細胞進行傳代培養，在細胞沉淀中加入細胞外基質（>70%）并在冰上混勻（注意，混勻吹打的動作要輕柔，切忌產生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內），混勻后置于冰上。

4、種板培養：用移液器吸去細胞外基質和細胞的混合液移至培養板孔中，（如24孔細胞培養板每孔點20~30μL混合懸液），混合懸液須點在培養孔底部中央位置，其鋪開后不可接觸培養孔側壁。將培養本放入37℃，在5%二氧化碳細胞培養箱中孵育15分鐘，待細胞外基質凝固至不再流動后，沿孔壁緩緩加入完全培養基（以24孔為例，加500μL完全培養基），每3~4天更換一次完全培養基。

5、持續培養：將細胞培養板放入培養箱中進行培養，每1天于倒置顯微鏡下觀察結直腸癌類器官的生長狀態，每3天于倒置顯微鏡下拍照，記錄多個視野中的結直腸癌類器官的形態和分布。