模基生物小鼠氣管類器官培養(yǎng)基套裝

產(chǎn)品描述

模基生物小鼠氣管類器官培養(yǎng)基套裝是一種化學(xué)定義的細(xì)胞培養(yǎng)基，用于建立和維持來自小鼠氣管干細(xì)胞的小鼠氣管類器官。氣管的自我更新上皮細(xì)胞是由基底細(xì)胞的增殖驅(qū)動的。小鼠氣管類器官包含基底細(xì)胞、纖毛細(xì)胞、分泌細(xì)胞和少量神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，因此類器官顯示了氣道的所有特征。因此，上皮細(xì)胞在結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型組成和自我更新動力學(xué)方面具有很大的應(yīng)用前景，可用于氣道穩(wěn)態(tài)與疾病的研究。

產(chǎn)品信息

其他自備材料和試劑

MG&ABW基質(zhì)膠

上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基

類器官消化液

潤洗液

類器官冷凍保存培養(yǎng)基(無血清)  

胎牛血清（FBS）

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂  

小鼠氣管類器官完全培養(yǎng)基的制備

使用無菌操作技術(shù)配制小鼠氣管類器官完全培養(yǎng)基。以下是準(zhǔn)備 10mL 完全培養(yǎng)基的示例，如所需量不同，可相應(yīng)調(diào)整

用量。

1. 冰上解凍 Mouse Airway Organoid Supplement B (50x)和 Mouse Airway Organoid Supplement C (250x)。

注意： 解凍后，建議將 Mouse Airway Organoid Supplement B (50x)和 Mouse Airway Organoid Supplement C (250x)

分別分裝后保存取用，避免反復(fù)凍融。

2. 將 200uL Mouse Airway Organoid Supplement B (50x)，40uL Mouse Airway Organoid Supplement C (250x) 加至

9.76mL Mouse Airway Organoid Basal Medium 中，充分混合，配制成 10mL 小鼠氣管類器官完全培養(yǎng)基。

注意：配制后的小鼠氣管類器官完全培養(yǎng)基可在 2-8°C 儲存，建議在兩周內(nèi)使用。Mouse Airway Organoid Supplement

B(50x)內(nèi)含有細(xì)菌及真菌抗生素(50x)。

小鼠氣管類器官培養(yǎng)

小鼠氣管類器官的原代建立

1. 在含有抗生素的預(yù)冷DPBS中收集小鼠原代氣管組織。

2. 用DPBS沖洗兩次組織。

3.在細(xì)胞培養(yǎng)皿中使用外科剪刀或手術(shù)刀將組織切成1-3毫米的小碎片。

4. 用10mL類器官消化液在15mL離心管中37°C消化組織碎片，孵育時間從30分鐘到1小時不等。仔細(xì)監(jiān)測消化過程，每5-10分鐘搖一次離心管，或上下顛倒混勻。當(dāng)大多數(shù)組織碎片能夠通過1mL移液管尖端時，消化過程就完成了。

5. 將FBS加入組織消化液中，最終濃度為2%，用100 μm細(xì)胞過濾篩過濾。

6. 收集過濾后的細(xì)胞，在4℃下250g離心3分鐘。如發(fā)現(xiàn)明顯的紅色顆粒，抽吸上清，用2mL紅細(xì)胞裂解液重懸紅細(xì)胞在室溫下靜置1分鐘，然后在4℃下250g離心3分鐘。

7. 棄去上清液，將顆粒重懸于上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在4℃下250g離心3分鐘，再次重復(fù)此步驟。

8. 棄去上清液，將細(xì)胞懸液重懸于基質(zhì)膠中。基質(zhì)膠應(yīng)該保存在冰上以防止固化，此步驟應(yīng)盡快完成。基質(zhì)的用量取決于基質(zhì)的大小，推薦重懸密度為每 10uL基質(zhì)膠懸液包含大約10,000個細(xì)胞。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

9.將基質(zhì)膠和組織細(xì)胞的混合懸液點(diǎn)入 24 孔板底部正中央，每孔 30uL 左右，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

8. 將接種完成后的培養(yǎng)板至于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15-25分鐘待基質(zhì)膠凝固。

9. 配制小鼠氣管類器官完全培養(yǎng)基。

10. 待基質(zhì)膠完全凝固后，加入已配制好的小鼠氣管類器官完全培養(yǎng)基，24 孔板每孔 500uL。

11. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到類器官需要進(jìn)一步的實(shí)驗。

類器官的傳代培養(yǎng)

1. 用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng) 過潤洗液潤洗的 1.5mL EP 管中。

2. 用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，使得類器官與基質(zhì)膠分離。

3.250g 離心力室溫離心 3min。

4.棄上清，使用類器官消化液或用機(jī)械破壞。對于使用類器官消化液的細(xì)胞解離，在類器官消化液中重懸類器官懸浮液，移液器反復(fù)上下吹打并置于37°C孵育，直至類器官解離。使用帶濾芯移液頭每2分鐘反復(fù)上下吹吸8次，以幫助破壞類器官。密切監(jiān)視消化過程使在類器官解離液中的孵育時間最短。如發(fā)生機(jī)械故障，在1.5 mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中重懸類器官懸液。小心地用移液管吸取類器官懸浮液，反復(fù)上下30次，這將有助于消化。

警告:不要在類器官解離液中解離超過5分鐘，因為這可能會導(dǎo)致較差的類器官的生長甚至破壞。根據(jù)經(jīng)驗，如果是小塊細(xì)胞的混合物，可以觀察到由10-50個細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，消化就完成了。

5. 消化完成后，用1ml上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行一次沖洗，然后室溫下250g離心3分鐘。

6. 棄上清，用適量的基質(zhì)膠重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30s 以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7. 將基質(zhì)膠和類器官的混合懸液點(diǎn)入 24 孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔 30uL 左右。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

8. 將接種完成后的培養(yǎng)板至于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15min 左右待基質(zhì)膠凝固。

9. 配制小鼠氣管類器官完全培養(yǎng)基。

10. 待基質(zhì)膠完全凝固后，加入已配制好的小鼠氣管類器官完全培養(yǎng)基，24 孔板每孔 500uL。

11. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到類器官需要進(jìn)一步的實(shí)驗。