模基生物豬小腸類器官培養基套裝

產品描述

    廈門模基生物豬小腸類器官培養基套裝是一款用于建立和維持豬小腸干細胞來源類器官的完全培養基。生長在該完全培養基中的豬小腸類器官主要由腸干細胞、腸祖細胞和腸絨毛細胞、潘氏細胞、 杯狀細胞和少量腸內分泌細胞組成，在自我更新能力、組織結構、細胞類型和功能方面，豬小腸類器官重現了體內小腸上皮的特征，因此是腸道體外研究的理想體外模型。

產品信息

其他自備材料和試劑

ABW &模基生物基質膠

組織消化液

上皮類器官基礎培養基

類器官冷凍保存培養基(無血清)  

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂  

豬小腸類器官完全培養基的制備

使用無菌操作技術配制豬小腸類器官完全培養基。以下是準備 10mL 完全培養基的示例，如所需量不同，可相應調整

用量。

1.冰上解凍 Porcine Intestinal Organoid Supplement B (50x)和 Porcine Intestinal Organoid Supplement C (250x)。

注意： 解凍后，建議將Porcine Intestinal Organoid Supplement B (50x)和 Porcine Intestinal Organoid Supplement C (250x)

分別分裝后保存取用，避免反復凍融。

2. 將 200uLPorcine Intestinal Organoid Supplement B (50x)，40uL Porcine Intestinal Organoid Supplement C (250x) 加至

9.76mL Porcine Intestinal Organoid Basal Medium 中，充分混合，配制成 10mL 豬小腸類器官完全培養基。

注意：配制后的豬小腸類器官完全培養基可在 2-8°C 儲存，建議在兩周內使用。Porcine Intestinal Organoid Supplement

B(50x)內含有細菌及真菌抗生素(50x)。

豬小腸類器官原代培養 

1. 依據所在單位批準的實驗動物倫理及操作規范進行動物組織取材，取材后的組織須在 2 - 8℃組織保存液或DPBS 中迅速轉運至潔凈實驗室進行組織處理和干細胞分離。

2. 準備若干培養皿，加入 4℃預冷的 DPBS 備用。

3. 標準手術操作分離豬腸組織，根據實驗需求取總長度 1 - 10 cm 的小腸段，置于含 DPBS 的培養皿中。

4. 于生物安全柜中使用移液管將小腸一端注入 DPBS 以沖洗腸內容物，沖洗后置于新的含 DPBS 的培養皿中，反

復沖洗數次至內容物完全被沖洗干凈，置于新的含 DPBS 的培養皿中。

5. 使用手術剪將腸管剪開，腸腔面朝上，一只手持手術鑷夾住腸組織一端，另一只手持手術刀片輕輕刮去腸腔表

面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含 DPBS 的培養皿中清洗，重復清洗一次。

6. 將清洗后的小腸組織剪碎至約 2 mm 長寬，并轉移至 5 - 10 mL 含有 2 mM EDTA 的預冷 DPBS 中消化，4℃孵

育 30 min。

7. 消化完成后，將組織碎片轉移到新的含 DPBS 的培養皿中清洗，重復一次以去除 EDTA。

8. 用 5 mL 移液管在含冷的 DPBS 的培養皿或 50 mL 離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復穿過移液管尖以產生機械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當可以看到大量的隱窩樣結構后，停止吹打并

將吹打后的組織懸液通過 70 μm 濾器過濾。

9. 收集濾液，300×g，4℃離心 3 min。

10. 棄上清，使用 1 mL DPBS 重懸組織沉淀，取 20 μL 懸液進行鏡檢和隱窩計數，計數完成后吸取包含所需隱窩量

的懸液，300×g，4℃離心 3 min，棄上清后置于冰上預冷。

11. 用適量的模基生物專用類器官基質膠重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每 25 μL 基質膠懸液包含 100 - 500 個隱窩，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30 s 以避免基質膠過早凝固。

注意：基質膠稀釋比例應在 70%以上以保證培養過程中基質膠的結構穩定性。

12. 將基質膠和組織細胞小心均勻混合以防止氣泡產生并將懸液加入 24 孔板，25 μL 每孔滴加在孔底中心，避免懸

液接觸孔板側壁。

注意：為防止基質膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

13. 將接種完成后的培養板置于 37℃二氧化碳恒溫培養箱中，孵育 15 min 左右待基質膠凝固后取出。

14. 提前配制豬小腸類器官完全培養基。

注意：原代或細胞分選后的類器官建立，需要在前 2 d 的培養體系中加入 10 μM 的二氫氯化物。

15. 每孔沿孔壁加入 500 μL 提前預熱的豬小腸類器官完全培養基，再向 24 孔板最外周孔中每孔加入 500 μL 無菌

水，置于 37℃溫箱、5% CO₂條件下培養。

注意：請沿孔壁緩慢加入，避免破壞已凝固結構。

16. 每 3 d 更換一次培養基，更換培養基時應避免破壞基質膠。

17. 密切監測類器官生長狀態，理想情況下應在 5 - 7 d 內建成。

豬小腸類器官傳代培養

1. 用經過潤洗液潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養基的懸液轉移至經過潤洗液潤洗的 1.5 mL EP 管中。

2. 用經過潤洗液潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，多次吹打使得類器官與基質膠分離。

3. 300×g，4℃離心 3 min，棄上清，用經過潤洗液潤洗的槍頭加入 200 μL 類器官消化液并充分混勻，37℃條件下消化 1 - 3 min，消化結束后加入 1 mL上皮類器官基礎培養基吹打混勻。

4. 300×g，4℃離心 3 min，棄上清，再次加入 1 mL上皮類器官基礎培養基并混勻。

5. 300×g，4℃再次離心 3min，棄上清后置于冰上。

6. 用適量的基質膠重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30 s 以避免基質膠過早凝固。

注意：基質膠稀釋比例應在 70%以上以保證培養過程中基質膠的結構穩定性。

7. 將基質膠和類器官的混合懸液點入 24 孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側壁，每孔 30 μL 左右。

注意：為防止基質膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

8. 將接種完成后的培養板至于 37℃二氧化碳恒溫培養箱中，孵育 15 min 左右待基質膠凝固后取出。

9. 配制豬小腸類器官完全培養基。

10. 待基質膠完全凝固后，沿孔壁加入提前預熱的豬小腸類器官完全培養基，24 孔板每孔 500 μL。

11. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養箱中培養，待長出新的類器官之后可進行后續實驗。