模基生物人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)基套裝

產(chǎn)品描述

廈門模基生物人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)基套裝是一種化學(xué)定義的細(xì)胞培養(yǎng)基，用于建立和培養(yǎng)成人干細(xì)胞衍生的人結(jié)腸類器官。 通過位于隱窩的干細(xì)胞及其祖細(xì)胞的增殖來驅(qū)動(dòng)結(jié)腸上皮細(xì)胞的自我更新，使人類結(jié)腸類器官顯示出所有的特征。在結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型組成和自我更新動(dòng)力學(xué)方面，結(jié)腸上皮的影響很大。人類結(jié)腸發(fā)育和疾病的研究前景是前所未有的，人類結(jié)腸類器官也可能應(yīng)用于再生生物學(xué)中的結(jié)腸上皮的體外擴(kuò)張。

產(chǎn)品信息

其他自備材料和試劑

ABW &模基生物基質(zhì)膠

上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基  

類器官消化液  

潤(rùn)洗液

類器官冷凍保存培養(yǎng)基(無血清)  

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂  

胎牛血清(FBS)  

EDTA 

人結(jié)直腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基和穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基的制備

采用無菌技術(shù)制備人結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基和穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基。在人結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的類結(jié)腸器官絕大多數(shù)由LGR5干細(xì)胞，循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)增(TA)細(xì)胞，早期腸細(xì)胞和少量杯狀細(xì)胞組成。在人結(jié)腸類器官穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的類結(jié)腸器官含有LGR5干細(xì)胞、TA細(xì)胞、早期和成熟腸細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、M細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞，以及少量簇狀細(xì)胞。

以下是準(zhǔn)備 10mL 完全培養(yǎng)基的示例，如所需量不同，可相應(yīng)調(diào)整用量。

1.冰上解凍人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子B、人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子C、人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子D。

注意： 解凍后，建議將人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子B、人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子C、人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子D分別分裝后保存取用，避免反復(fù)凍融。

2. 配制人結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基，專門用于原代培養(yǎng)和復(fù)蘇。添加200 μL人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子B (50x)、40 μL人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子C (250x)、40 μL人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子D (250x)、至9.72 mL人結(jié)腸類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混合均勻。

3.配制人結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基，專門用于培養(yǎng)傳代。添加200 μL人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子B (50x)、40 μL人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子C (250x)至9.76 mL人結(jié)腸類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混合均勻。

注意：配制后的人結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基和穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基可在 2-8°C 儲(chǔ)存，建議在兩周內(nèi)使用。人結(jié)腸類器官培養(yǎng)因子B(50x)內(nèi)含有細(xì)菌及真菌抗生素(50x)。

人結(jié)腸類器官的原代建立

注意：涉及主要人體組織材料的研究必須遵循所有相關(guān)的機(jī)構(gòu)和政府法規(guī)。在收集主要人體組織材料之前，必須獲得所有受試者的知情同意。

從初級(jí)組織中建立類器官

1. 使用離心管將原代人結(jié)腸組織收集在冰冷的原代組織儲(chǔ)存液中，將組織樣本保存在4°C，直到開始分離。

2. 評(píng)估獲得的組織碎片是否完全由上皮組織組成。如果存在脂肪或肌肉組織，請(qǐng)?jiān)诮馄曙@微鏡下使用手術(shù)剪刀或手術(shù)刀和鑷子盡可能多地去除這些非上皮成分。如果沒有脂肪或肌肉組織，請(qǐng)立即繼續(xù)下一步。

3.用上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基或DPBS沖洗結(jié)腸組織，直到上清澄清。

4. 在腺窩結(jié)構(gòu)分離之前，將基質(zhì)膠解凍并保持低溫。加入5 mL FBS至45 mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中制備10%FBS培養(yǎng)基。

5. 將組織在細(xì)胞培養(yǎng)皿中使用外科剪刀或手術(shù)刀切成5mm³的小碎片。

注：分離的樣品必須足夠小，能夠通過10ml移液管的尖端。

6.將分離的樣品放入一個(gè)15毫升的離心管中，管中含有10ml預(yù)冷的DPBS。

7.用10ml移液管清洗樣品至少10次。

注：在接下來的步驟中，使用10%FBS培養(yǎng)基潤(rùn)洗10ml移液管的內(nèi)表面以避免樣品粘在移液管壁上。

8.讓管子靜止不動(dòng)，直到樣品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清液，加入10mL預(yù)冷DPBS。

9. 重復(fù)步驟7和8 3-5次，直到上清完全清澈。

注：徹底清洗樣品是避免細(xì)菌污染的關(guān)鍵。

10. 向試管中加入10ml預(yù)冷DPBS，并加入2.5 mM EDTA 。把管子放在搖床上，在4°C的溫度下輕輕搖動(dòng)40分鐘。

11. 用EDTA處理后，保持試管靜止，直到樣品沉淀到試管底部，然后用10ml移液管取上清液，加入10ml預(yù)冷DPBS。

12. 讓管子靜止不動(dòng)，直到樣品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清。

13. 加入10ml預(yù)冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。隱窩結(jié)構(gòu)會(huì)通過移液吸頭釋放到上清液中。將含有分離的隱窩的上清液放入新的15ml管中。

14. 加入10ml預(yù)冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。允許組織碎片在正常重力下下沉至少30秒鐘。隱窩被通過移液釋放到上清液中。將含有分離的隱窩的上清液放入一個(gè)新的15ml管中。

15. 在4℃、400g條件下離心3分鐘。吸出并丟棄上清。

16. 將沉淀重懸在1ml DPBS中，并將隱窩懸浮液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL管中。滴20 μL隱窩重懸液到培養(yǎng)皿中。在立體顯微鏡下計(jì)數(shù)隱窩的數(shù)量并計(jì)算隱窩的總數(shù)。

17. 在4℃、400g條件下離心3分鐘。吸出并丟棄上清。

18. 吸取上清，將沉淀重懸于基質(zhì)膠中。基質(zhì)膠應(yīng)保存在冰上以防止固化。推薦重懸密度為每 25 μL基質(zhì)膠懸液包含 100 - 500 個(gè)隱窩，重懸后置于冰上，重懸時(shí)間不超過 30 s 以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中 基質(zhì)膠 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

19. 將基質(zhì)膠和組織細(xì)胞小心均勻混合以防止氣泡產(chǎn)生并將懸液加入 24 孔板，30 μL每孔滴加在孔底中心，避免

懸液接觸孔板側(cè)壁。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

20. 將接種完成后的培養(yǎng)板置于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15 -25min 左右待基質(zhì)膠凝固后取出。

21. 每孔沿孔壁加入 500 μL 提前預(yù)熱的人結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基，再向 24 孔板最外周孔中每孔加入 500 μL 無菌水， 置于 37℃溫箱、5% CO2條件下培養(yǎng)。

注意：請(qǐng)沿孔壁緩慢加入，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。