模基生物小鼠小腸類器官培養(yǎng)基套裝

產(chǎn)品描述

廈門模基生物小鼠小腸類器官培養(yǎng)基套裝是一款用于建立和維持小鼠腸道成體干細(xì)胞來源小腸類器官的完全培養(yǎng)基。生長(zhǎng)在該完全培養(yǎng)基中的小鼠小腸類器官主要由干細(xì)胞、腸祖細(xì)胞和腸絨毛細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和少量腸內(nèi)分泌細(xì)胞組成，在自我更新能力、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型和功能方面，小鼠小腸類器官重現(xiàn)了體內(nèi)小腸上皮的特征，因此是腸道穩(wěn)態(tài)和疾病機(jī)制研究的理想體外模型。

產(chǎn)品信息

其他自備材料和試劑

MG&ABW基質(zhì)膠

潤(rùn)洗液

類器官冷凍保存培養(yǎng)基(無血清)  

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂  

小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基的制備

使用無菌操作技術(shù)配制小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基。以下是準(zhǔn)備 10mL 完全培養(yǎng)基的示例，如所需量不同，可相應(yīng)調(diào)整

用量。

1. 冰上解凍 Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)和 Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x)。

注意： 解凍后，建議將 Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)和 Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x)

分別分裝后保存取用，避免反復(fù)凍融。

2. 將 200uL Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)，40uL Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x) 加至

9.76mL Mouse Intestinal Organoid Basal Medium 中，充分混合，配制成 10mL 小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基。

注意：配制后的小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基可在 2-8°C 儲(chǔ)存，建議在兩周內(nèi)使用。Mouse Intestinal Organoid Supplement

B(50x)內(nèi)含有細(xì)菌及真菌抗生素(50x)。

小鼠小腸類器官原代培養(yǎng)

1. 依據(jù)所在單位批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理及操作規(guī)范犧牲小鼠。

2. 準(zhǔn)備若干培養(yǎng)皿，加入 4℃預(yù)冷的 DPBS 備用。

3. 標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)操作取小鼠小腸，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求取總長(zhǎng)度約 3 厘米至 20 厘米的小腸段，置于含 DPBS 的培養(yǎng)皿中。

4. 使用移液管或者注射器往小腸一端注入 DPBS 以沖洗腸內(nèi)容物，沖洗后置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中，重復(fù)沖

洗數(shù)次至內(nèi)容物完全被沖洗干凈，置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中。

5. 使用手術(shù)剪將腸管剪開，腸腔面朝上，一只手使用手術(shù)鑷夾住腸組織一端，另一只手使用手術(shù)刀片輕輕刮去腸

腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)清洗一次。

6. 將清洗后的小腸組織剪碎至 2mm 寬，并轉(zhuǎn)移至含有 5mmol/L EDTA 的預(yù)冷 DPBS 中消化，置于 4℃孵育30min。

7. 消化完成后，將組織碎片轉(zhuǎn)移到新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)一次以去除 EDTA。

8. 用 5mL 移液管在含冷的 DPBS 的培養(yǎng)皿或 50mL 離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復(fù)穿過移液管尖以產(chǎn)

生機(jī)械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當(dāng)可以看到大量的隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打，并

對(duì)吹打后的組織懸液進(jìn)行 70μm 濾網(wǎng)過濾。

9. 收集穿過濾網(wǎng)的組織懸液，150g 離心力 4℃離心 3min。

10. 棄上清，使用 1mL DPBS 重懸組織沉淀，取 20uL 懸液進(jìn)行鏡檢和隱窩計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)完成后吸取包含所需隱窩量

的懸液，150g 離心力 4℃離心 3min，棄上清后置于冰上。

11. 用適量的基質(zhì)膠重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每 10uL基質(zhì)膠懸液包含 200 至 600 個(gè)隱窩，重懸后置于

冰上，重懸時(shí)間不超過 30s 以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

12. 將基質(zhì)膠和組織細(xì)胞的混合懸液點(diǎn)入 24 孔板底部正中央，每孔 30uL 左右，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

13. 將接種完成后的培養(yǎng)板至于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15min 左右待基質(zhì)膠凝固。

14. 配制小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基。

15. 待基質(zhì)膠完全凝固后，加入已配制好的小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基，24 孔板每孔 500uL。

注意：請(qǐng)沿壁緩慢加入，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

16. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

17. 每 3 天更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)避免破壞 Matrigel。

18. 密切監(jiān)測(cè)類器官生長(zhǎng)狀態(tài)，理想情況下，小鼠小腸類器官應(yīng)在 5 至 7 天內(nèi)建成。

小鼠小腸類器官傳代培養(yǎng)

19. 用經(jīng)過潤(rùn)洗液潤(rùn)洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)

過潤(rùn)洗液潤(rùn)洗的 1.5mL EP 管中。

20. 用經(jīng)過潤(rùn)洗液潤(rùn)洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，使得類器官與基質(zhì)膠分離。

21. 150g 離心力 4℃離心 3min，棄上清，使用 DPBS 重懸底部類器官沉淀，150g 離心力 4℃再次離心3min，棄上

清后置于冰上。

22. 用適量的基質(zhì)膠重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時(shí)間不超過 30s 以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

23. 將基質(zhì)膠和類器官的混合懸液點(diǎn)入 24 孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔 30uL 左右。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

24. 將接種完成后的培養(yǎng)板至于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15min 左右待基質(zhì)膠凝固。

25. 配制小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基。

26. 待基質(zhì)膠完全凝固后，加入已配制好的小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基，24 孔板每孔 500uL。

27. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。