模基生物人氣管類器官培養基套裝

產品描述

廈門模基生物人氣管類器官培養基套裝是一種化學定義的細胞培養基，用于建立和維持來自人類氣管干細胞的人氣管類器官。氣管的自我更新上皮細胞是由基底細胞的增殖驅動的。人氣管類器官包含基底細胞、纖毛細胞、分泌細胞和少量神經內分泌細胞，因此類器官顯示了氣管的所有特征。因此，上皮細胞在結構、細胞類型組成和自我更新動力學方面具有很大的應用前景，可用于氣管穩態與疾病的研究。

產品信息

其他自備材料和試劑

MG&ABW基質膠

組織消化液

上皮類器官基礎培養基

紅細胞裂解液

類器官消化液

潤洗液

類器官冷凍保存培養基(無血清)  

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂  

人氣管類器官完全培養基的制備

使用無菌操作技術配制人氣管類器官完全培養基。以下是準備 10mL 完全培養基的示例，如所需量不同，可相應調整

用量。

1. 冰上解凍 Human Airway Organoid Supplement B (50x)和 Human Airway Organoid Supplement C (250x)。

注意： 解凍后，建議將 Human Airway Organoid Supplement B (50x)和 Human Airway Organoid Supplement C (250x)

分別分裝后保存取用，避免反復凍融。

2. 將 200uL Human Airway Organoid Supplement B (50x)，40uL Human Airway Organoid Supplement C (250x) 加至

9.76mL Human Airway Organoid Basal Medium 中，充分混合，配制成 10mL 人氣管類器官完全培養基。

注意：配制后的人氣管類器官完全培養基可在 2-8°C 儲存，建議在兩周內使用。Human Airway Organoid Supplement

B(50x)內含有細菌及真菌抗生素(50x)。

人氣管類器官原代培養

注意:涉及初級人體組織材料的研究必須遵循所有相關機構和政府的規定規定。在采集原始人體組織之前，必須獲得所有受試者的知情同意。

從原始組織中建立類器官

1.收集經活檢或手術獲得的原代人氣管組織塊，保存在冰冷的原代組織庫中溶液于離心管中。將組織樣本保存在4°C，直到開始分離。

2.評估獲得的組織片是否純由上皮組織組成，或是否也包含脂肪或肌肉組織。如果是這樣，盡可能在解剖顯微鏡下使用外科剪刀或手術刀和鑷子去除非上皮性成分。如果沒有脂肪或肌肉組織，立即繼續下一步。

3.用上皮類器官基礎培養基或DPBS沖洗氣管組織兩次。

4.將組織在細胞培養皿中使用外科剪刀或手術刀切成1-3毫米的小碎片。

5.用10mL組織消化液在15mL離心管中37°C消化組織碎片，孵育時間從30min到1h不等。仔細監測消化過程，每5-10分鐘通過劇烈搖動或反復吹吸移液來混合液體。當大多數組織碎片能夠通過1mL移液管尖端時，消化過程即完成。

6. 將FBS加入組織消化液中，最終濃度為2%，用100 μm細胞篩過濾。

7. 收集過濾后的細胞，在4℃下250g離心3分鐘。如發現明顯的紅色顆粒，抽吸上清，用2mL紅細胞裂解液重懸，紅細胞在室溫下靜置1分鐘，然后在4℃下250g離心3分鐘。

8. 棄去上清液，將細胞懸液重懸于上皮類器官基礎培養基，在4℃下250g離心3分鐘。再次重復此步驟。

9. 棄去上清液，將細胞懸液重懸于基質膠中。基質膠應該保存在冰上以防止固化，此步驟應盡快完成。基質的用量取決于基質的大小，推薦重懸密度為每 10uL基質膠懸液包含大約10,000個細胞。

注意：基質膠稀釋比例應在 70%以上以保證培養過程中基質膠的結構穩定性。

10. 將基質膠和組織細胞的混合懸液點入 24 孔板底部正中央，每孔 30uL 左右，避免懸液接觸孔板側壁。

注意：為防止基質膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

11. 將接種完成后的培養板至于 37℃二氧化碳恒溫培養箱中，孵育 15min 左右待基質膠凝固。

12. 準備所需量的人氣管類器官完全培養基。

13.待基質膠完全凝固后，加入已配制好的人氣管類器官完全培養基，24 孔板每孔 500uL。

注意：請沿壁緩慢加入，避免破壞已凝固結構。

14. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養箱中培養。

15. 每 3 天更換一次培養基，更換培養基時應避免破壞基質膠。

16. 密切監測類器官生長狀態，理想情況下，人氣管類器官應在 7 至 10 天內建成。 

人氣管類器官傳代培養

1. 用經過潤洗液潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養基的懸液轉移至經 過潤洗液潤洗的 1.5mL EP 管中。

2. 用經過潤洗液潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，使得類器官與基質膠分離。

3.250g 離心力室溫離心 3min。

4.棄上清，使用類器官消化液或用機械破壞。對于使用類器官消化液的細胞解離，在類器官消化液中重懸類器官懸浮液，移液器反復上下吹打并置于37°C孵育，直至類器官解離。使用帶濾芯移液頭每2分鐘反復上下吹吸8次，以幫助破壞類器官。密切監視消化過程使在類器官解離液中的孵育時間最短。如發生機械故障，在1.5 mL上皮類器官基礎培養基中重懸類器官懸液。小心地用移液管吸取類器官懸浮液，反復上下30次，這將有助于消化。

警告:不要在類器官解離液中解離5分鐘，因為這可能會導致較差的類器官的生長甚至破壞。根據經驗，如果是小塊細胞的混合物，可以觀察到由10-50個細胞組成的細胞團，消化就完成了。

5. 消化完成后，用1ml上皮類器官基礎培養基進行一次沖洗，然后室溫下250g離心3分鐘。

6. 棄上清，用適量的基質膠重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30s 以避免基質膠過早凝固。

注意：基質膠稀釋比例應在 70%以上以保證培養過程中基質膠的結構穩定性。

7. 將基質膠和類器官的混合懸液點入 24 孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側壁，每孔 30uL 左右。

注意：為防止基質膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

8. 將接種完成后的培養板至于 37℃二氧化碳恒溫培養箱中，孵育 15min 左右待基質膠凝固。

9. 配制人氣管類器官完全培養基。

10. 待基質膠完全凝固后，加入已配制好的人氣管類器官完全培養基，24 孔板每孔 500uL。

11. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養箱中培養，直到類器官需要進一步的實驗。