FAQ

1.基質膠是否需要稀釋，稀釋比例是多少？不同孔板添加的體積是多少？

由于每一批ABW^®Matrigengel基底膜基質濃度會有差異，針對標準濃度的基質膠，建議根據以下表格進行稀釋。

稀釋比例	96孔板	24孔板
無稀釋	50μL原膠/孔	200μL原膠/孔
1:1	25μL原膠+ 25μLDMEM/孔	100μL原膠+ 100μLDMEM/孔
2:1	33.3μL原膠+ 16.7μLDMEM/孔	133.3μL原膠+ 66.7μLDMEM/孔

 

技巧一：判斷是否加入合適體積的基質膠？

 

將孔板下面放置一張格子紙（如圖），垂直透過每個孔觀察下面的格子紙：

（1）如果觀察到的格子比實際尺寸小，判斷基質膠加入體積不足；

（2）如果觀察到的格子比實際尺寸大，判斷基質膠加入體積過多；

（3）如果觀察到的格子與實際尺寸一致，判斷基質膠加入體積合適。

 

2. 為什么我鋪的基質膠液面總是不平？或者有氣泡？

a) 收貨時確?；|膠是固態，并在干冰中儲存，收貨后基質膠儲存在-20℃。儲存方式不當可能導致基質膠的質量受損，容易使膠面不平及產生氣泡。

b) 基質膠應置于碎冰上并4℃過夜融化，確保所有操作在冰上進行。高溫可能加速膠凝固，導致膠面不平及產生氣泡。

c) 向孔板中加基質膠前使用渦旋振蕩的方式保證膠液處于均勻的狀態，如果膠濃度高可考慮做適當稀釋。

d) 向孔板中加基質膠時盡可能垂直加入，避免氣泡產生。

技巧二：剛加膠時出現明顯的氣泡，可使用吸頭輕觸戳破。

 

3.為什么我的成管實驗中細胞不能形成連續的網格？

a) 建議使用3-5代狀態較好且融合度70%-80%的HUVEC細胞進行成管試驗，此時細胞成管能力比較強。

b) 在使用胰酶消化細胞時，在顯微鏡下邊觀察邊消化，當細胞變圓時及時終止消化過程。消化過度會影響成管。

c) 盡可能保證細胞數量為約3萬個/孔，細胞數量過少會使細胞無法形成連續的網絡。

d) 選擇低生長因子基質膠進行成管實驗時，可考慮在培養基中添加生長因子刺激細胞成管。

技巧三：由于計數方式的差異可能導致細胞數量的差異，可進行預實驗測試合適的細胞數鋪板，細胞靜置后鏡下觀察如下圖數量比較適宜。

 

4.成管實驗到底需要幾個小時？6個小時？20個小時？小管形成后有塌縮了？

a) 成管時間與細胞狀態密切相關。細胞狀態好時，2-3小時開始成管，細胞狀態較差時，可能18-24h成管。建議第一次實驗時，每4個小時觀察一次。

b) 成管時間取決于培養基中血管生成因子的濃度，腫瘤條件培養基中血管生成因子較豐富，容易成管，而基礎培養基成管時間較久。

c) 如果使用原代內皮細胞而非永生化細胞，開始成管的時間會延遲幾個小時。

d) 小管形成后有塌縮:可能是培養時間過久，內皮細胞發生凋亡導致。

 

5.其他注意事項：

a) HUVEC細胞容易沉底，易使孔間細胞數量不一致，細胞數量不一致會影響成管結果，數量多的孔容易成管。每孔加樣前需用移液器吹打混勻。

b) 基質膠濃度高時，移液器吸入的體積可能不準，可用無菌剪剪去槍頭前端后再去吸入基質膠。

c) 實驗前一天無血清饑餓細胞，第二天成管效果會更好。

 

如果您希望做出更精美的熒光成管圖片，更有說服力的統計結果以及更多的血管相關實驗，請持續關注公眾號或者留言，我們將一一為您介紹！